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RNA 操作注意事项与实验技巧

发布时间:2021-10-17      点击次数:545

一、操作注意事项:


由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。为了保证RNA的研究工作成功,请仔细阅读下列注意事项,相信它能帮助您解决常见的问题。


归根究底,RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在,在实验操作的任何一步,任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNA酶污染,从而导致整个实验失败。因此,严格控制实验条件,避免任何可能的污染是保证实验成功的关键,必须做到以下几点:


1. 如果可能,实验室应辟出专门RNA操作区,离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁,并定期进行消毒。


2. 操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套,并经常更换,以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身,常常造成操作不便,而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递,扩大污染。


3. 尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品,尽量避免与其它实验共享器具,以防止交叉污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管,大多国外厂商供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染,买来后可直接用于RNA操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品,往往由于二次污染而带有RNA酶,从而导致实验失败。


4. 配制溶液用的酒精,异丙醇、Tris等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制(加0.01%(体积比)DEPC至重蒸水或Mili Q级水中,处理过夜,灭菌即成DEPC水)。


5. 所有玻璃制品都必须在240℃烘烤4小时。所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟,并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌,也可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜,然后灭菌,烘干。无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次,这样通常可以消除RNA酶的活性。


二、样本保存的注意事项:


样本一旦从生物体中分离后,细胞内的RNA就变得非常不稳定,容易降解。因此取样后,如何保证取样前后基因的表达模式不变,就变得非常重要。传统方法是用液氮速冻,再放到超低温冰箱中保存。


目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂,如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和稳定RNA作用的试剂,将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中,即可起到稳定样本中RNA的作用。无需液氮或干冰,方便安全地在室温下保存一段时间,低温可长期保存。还有对细菌样本专用的RNAprotect Bacteria Reagent及对血液样本专用的PAXgene™ Blood RNA System。


三、RNA的定量与纯度:


RNA通常用分光光度计定量,测量在260 nm处的吸收值(A260)。通常分光光度计A260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的,因此RNA提取结束后,要根据大概产量稀释(推荐用10 mM Tris-HCl, pH 7.0稀释)到适当浓度范围,再用分光光度计测量。A260为1相当于RNA的浓度为40ug/ml。


为了检测RNA的纯度,可以测量A260与A280的比值,通常纯RNA的A260/A280为1.9-2.1。

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