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Transwell侵袭实验总结

发布时间:2021-10-25      点击次数:270

1.Transwell肿瘤细胞迁移实验

过程与Transwell侵袭实验基本一致,不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为,由于没有基质胶的阻挡,细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快,所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁移实验的密度是1×106。另外,下层培养液的FBS浓度也可适当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁移实验的浓度是2.5%。

2.Transwell上皮细胞培养步骤

做了一段时间的原代细胞培养,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友共同探讨:
(1). 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管取出,置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV (Sigma),100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素(Gibco-BRL)、无Ca 2+、Mg2+,无血清的MEM。
(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞。
(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。
(4). 冲洗过后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力,若存活率大于90%,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上(12 mm SNAPWELL, Costar),以37°C 5%CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
(5). 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片

3. Transwell B16细胞的体外迁移实验

我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验,具体是这么做的:首先把Transwell倒置,在Transwell的PVPF膜(0.8 um)的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml,50ul),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的培养基(含10%血清)的24孔板内,后在Transwell的内室加入细胞(100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度),放入培养箱,12-18小时后,取出Transwell,用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下观察细胞,记数。

4.内皮细胞HMEC-1迁移实验

1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后,上室加入100µl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物,下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照,置于CO2培养箱中作用8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照,最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为:抑制率(%)=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/(OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照)] ×100%.


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