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PCR定量技术--PCR ELISA

发布时间:2021-10-25      点击次数:255

PCR自诞生以来,人们就在努力探索PCR定量的方法。荧光素染色凝胶电泳在PCR最初的一段时间是唯yi的检测技术,因此人们在凝胶电泳的基础上使用扫描照片进行光密度分析,以求实现PCR的相对定量。

  但是由于普通凝胶电泳检测本身的不特异性,只能进行粗略的相对定量,难以满足人们日益对精确定量的渴望,不过由于普通凝胶电泳光密度分析简捷易行,成本低,目前还是科研还很常用。但是难以满足临床应用的要求。

   由于固相捕获技术的成熟和应用,特别是酶联免疫吸附试验(ELISA)的成功,给核酸定量提供了一个思路。此后,应用固相捕获的PCR定量技术应运而生。即在PCR扩增以后,在微也板上借用酶联免疫吸附试验(ELISA)的原理,使用酶标抗体,进行固相杂交来实现定量。被称为PCR-ELISA :

PCR-ELISA原理:

  首先,使用亲和素包被微孔板,再用生物素标记捕获探针3`端(捕获探针5`端和待检靶序列5`端的一段互补)通过生物素和亲和素的交联作用将捕获探针固定在微孔上,制成固相捕获系统。

其次,在扩增时,引物用抗原(生物素、地高xin、荧光素酶等)标记,这样扩增产物中就会代有抗原。

   用扩增产物与微孔上的捕获探针杂交,靶序列被捕获。再在微孔中加入用辣根过氧化物酶标记的抗体,抗体与靶序列上的抗原结合,再加入底物使之显色。从而实现定量。

   虽然PCR经过长时间的探索,PCR-ELISA逐渐成熟,并有了不同的改进版本,但总的还是没有脱离固相分离、酶标抗体的经典范畴。

PCR-ELISA的步骤:

1.核酸提取和制备

2.进行PCR扩增

3.微孔预杂交

4.产物杂交

5.显色

6.检测分析

PCR-ELISA的优点:

   PCR-ELISA相对于凝胶光密度定量,无论是灵敏度、特异性、准确度上都是很大的提高,能满足临床要求。它为PCR提供了第一个严格意义上的定量方法。并且对仪器要求较低。只要有扩增仪和酶标仪就可以进行。

PCR-ELISA的不足及消减措施:

    1.污染问题严重。PCR-ELISA在扩增之后又要进行ELISA反应,而ELISA是一个开放性的反应,特别是洗板,很容易产生污染引起假阳性。为减小污染,一定要严格分区隔离,以避免污染。同时,使用dUTP与UNG酶也可以在一定程度上减小污染的影响。由于PCR产物都是高浓度的。一般情况下,产物都被扩增至2的20方以上,即使避免了扩增前的污染,但同批样本产物之间的交叉污染可能远远大于ELISA,不能忽视。 

    2.显色定量分析相对于最近的探针荧光分析,无论是灵敏度还是特异性上都有差距。

    3.操作繁琐,这也是严重制约临床应用的重要因素。

注意:PCR-ELISA一定要严格分区,及时进行空间和仪器消毒,严防污染


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