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人类外周血染色体制备

发布时间:2021-10-26      点击次数:412

一、原理

人外周血小淋巴细胞,通常都处在G1期(或G0期),一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素(PHA),这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞,进入有丝分裂。短期培养后,经秋水仙素处理,低渗和固定,即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106~3×106个小淋巴细胞,足够染色体标本制备和分析之用。

二、用品和试剂

1. 5ml注射器(7号针尖),培养瓶、刻度吸管,需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片,经洗液按常规清洗、烘干备用。

2. 超净工作台,恒温培养箱,天平,离心机、显微镜等。

3. 试剂:

1)RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液,并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。

2)肝素钠(肝素):称取0.2g溶于100ml双蒸水中,浓度为0.2%,15磅20分钟灭菌。

3)秋水仙碱(秋水仙素〕,生理盐水配制成10μg/ml浓度,15磅20分钟灭菌,分装,置-20℃。

4)低渗液:0.35%KCl。

5)固定液(Carnoy固定液) 甲醇∶冰乙酸(3∶l),临时配制。

6)Giemsa工作液:1份原液和10份磷酸缓冲液,临时配制。

7)磷酸缓冲液:1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。

8)5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。

三、操作步骤

(一)细胞培养

1. 培养基的配制:

在超净工作台中,100ml培养基含以下成分和比例:

RPMI-1640 84ml

小牛血清 15ml

PHA 3支

肝素钠 1ml

卡那霉素 终浓度为100单位/ml

5% NaHCO3(无菌)或1N HCl调pH至7.2-7.4.

用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶),4℃备用。

2. 采血:酒精消毒皮肤,肘静脉采血0.3-0.5ml,立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞,10ml培养基中注入30-40滴全血,轻摇匀后置37℃恒温箱培养。

3.培养:时间为68小时。培养期间,定期轻摇匀,使细胞充分接触培养基。

4. 秋水仙素处理:终止培养前2-4小时,在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴,使终浓度为0.07μg/ml)。

以上步骤均需无菌操作

(二)染色体制备

1. 收集细胞:将培养物全部转入洁净离心管中,以1000rpm离心8-10分钟,弃上清液。

2. 低渗处理:向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml,用滴管混匀,置37℃恒温水浴中低渗15-25分钟。

3. 预固定:低渗后加入0.5ml固定液,轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。

4. 一固定:弃上清液,加入5ml固定液,轻轻混匀,静置20分钟。1000rpm离心,弃上清液。

5.二固定、三固定:同一固定。

6. 制悬液:弃上清液后,视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。

7. 滴片:吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上,轻吹散,气干。

8. 染色:1:10 Giemsa染色5-10分钟,细水洗去多余染液,气干。

9. 镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,油镜下观察染色体形态并计数。

四、注意事项

1. 培养温度应严格控制在37±0.5℃,培养液zui适合pH为7.2-7.4。

2. 秋水仙素处理时间过长,分裂细胞多,染色体短小;反之,则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。

3. 低渗使红细胞膜破裂,淋巴细胞膨胀,低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻,否则引起膜破裂、染色体散失。

4. 离心前配平,离心速度过高,细胞团不易打散;反之,细胞易丢失。

5. 固定液应在使用前临时配制。

6. 载玻片一定要洁净,否则染色体分散不好。

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