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外周血的简便提取方法

发布时间:2021-10-28      点击次数:359

从外周血提取DNA是一个经常遇到的问题,当然可以用试剂盒提取,不过代价还是有点大,并且不方便,定试剂总要等上几天,如果血液标本不稀缺资源,不妨用一些简便方法提取。

方法一

(1) 取抗凝血5ml在沉淀中加入15ml PBS,混匀,离心2000r/min10min。

(2) 将血浆转至新的试管中,-70℃保存。

(3) 将血细胞转入另一支试管中(10ml或50ml)加入尽可能多的冷的蒸馏水混匀。

(4) 将其插入冰内5~10min或放入-20℃15min。

(5) 将上述混合液从冰中或-20℃取出放至室温,离心2000r/min20min。

(6) 弃上清,收集沉淀。

(7) 在沉淀中加入15ml PBS,混匀,离心2000r/min10min。

此步骤重复3次至沉淀为淡红色或白色。

(8) 将沉淀转入小管,加少量PBS,每分钟5000r/min离心5min,去上清。

(9)沉淀-70℃保存。

方法二 简化盐析法 

取抗凝血500μl ,加入细胞裂解液Ⅰ1 ml (10 mmol/ L Tris2HCl ;10 mmol/L KCl , 10 mmol/ L MgCl2 , 2 mmol/ L EDTA 和2. 5 % TritonX2100) 混匀,6 000 r/ min 离心5 min ,重复裂解一次,

加细胞裂解液Ⅱ150μl (10 mmol/ L Tris2HCl ; 10 mmol/ L KCl , 10 mmol/ L MgCl2 , 2mmol/ L EDTA 和1 %SDS) 混匀,56 ℃恒温箱孵育15 min ;

加饱和NaCl 150μl ;混匀,10 000 r/ min 离心5 min ;

小心吸取水相,加2 倍体积的无水乙醇,轻轻混匀,12 000 r/ min 离心5 min ,

弃上清,待干,加50μl 无菌双蒸水溶解DNA ,备用。

方法三

取EDTA - NaI 抗凝血100μl 加入1. 5 ml 离心管中,加入1000μl 无菌去离子水,轻轻颠倒5~10次,5 000 r/ min 离心3 min ,弃去上清液1000μl ,

加入6 mol/ L Nal100μl ,混旋10 s ,加200μl 氯仿∶异戊醇(24∶1) ,混旋30 s ,

10 000 r/ min 离心3 min ,取上清液150μl 于另一离心管中,

加入90μl 异丙醇,混匀后,10 000 r/ min 5 min ,弃去上清液, 加入1 000μl 75 %无水乙醇洗涤沉淀2 次,再加入1 000μl无水乙醇洗涤沉淀2 次,

沉淀置56 ℃烘干20 min ,加入50μl 无菌去离子水或50μl TE 溶液

个人体会:方法一较复杂,需要用蛋白酶K,方法三不能保证蛋白被完全去除,将来影响试验,所以推荐方法二


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