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从外周血淋巴细胞中提取RNA

发布时间:2021-10-28      点击次数:209

实验试剂


1. Ficoll(Amersham Biosciences)

2. 冰冷磷酸盐缓冲液(PBS),pH 7.4

3. 裂解缓冲液:5mol/L单巯基氰酸胍,10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),50mmol/L Tris—HCl,1mmol/L二硫苏糖醇(DTT),用0.45微孔滤膜过滤

4. 4mol/L和3mol/L氯化锂,高压灭菌

5. RNA溶解缓冲液:0.1%SDS,lmmol/L EDTA,10mmol/LTris—HCl,pH 7.5,高压灭菌

6. 3mol/L乙酸钠,pH 4.8,焦碳酸二乙酯  (DEPC)  处理  (加0.2ml DEPC/100ml溶液)并灭菌

7. DEPC处理过的水  (0.2ml DEPC/100ml水),高压灭菌

8. 用Tris平衡的酚(Sigma)

9. 氯仿;异戊醇(24:1)(Sigma)

10. 100%乙醇,-20℃


实验设备

 

1. 30m1Corex管,酸洗并硅化

2. 预冷离心机和吊桶式转头


实验步骤

 

1.收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。

2.用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。

3.在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞,并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108 个外周血淋巴细胞),然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。

4.加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂,4℃孵育15~20小时(过夜)。

5.将悬液转移到30mlCorex管内,在吊桶式转头内4℃离心2小时,6500r/min。

6.弃去上清,并用Kimwipe擦拭试管口。用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬,收集沉淀.将沉淀重悬液离心,6500r/min 1小时。

7.弃去上清,用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下,彻底冷冻悬液。  

8.复溶悬液,每10分钟涡旋20秒,共45分钟。

9.用等体积酚抽提1次,并用等体积氯仿抽提1次。

10.加入1/10体积的3mol/L乙酸钠,pH 4.8和2体积一20℃乙醇。彻底混合溶液,并在-20℃下孵育过夜。

11.在吊桶式转头内离心RNA,12000r/min 30分钟。用0.2m1DEPC处理水重悬沉淀。将溶解的DNA转移至1.5m1微量离心管内,并加入1/10体积3mol/L乙酸钠,pH 4.8和2体积-20℃乙醇,重新沉淀。并以乙醇沉淀物形式保存RNA,直至准备使用时。

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